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李玉欣博士:近五年全球大豆蛋白类产品抗营养因子测定报告分析

发布时间:2022-07-07 02:54:29 来源:m6体育足球赛 作者:M6米乐官方app
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2022-07-07
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  各位辅音云讲堂的朋友们,大家好!我是来自丹麦哈姆雷特蛋白公司的李玉欣。去年借助辅音云讲堂平台与大家交流了一些大豆抗营养因子和动物营养关系的内容。由于哈姆雷特蛋白积累了大量大豆产品抗营养因子的数据,所以,今天再次借助辅音云讲堂跟大家分享一下相关数据库报告的趋势和结论。今天跟大家分享的主要内容有4个方面。

  我们知道大豆作为种子是用来繁殖后代的,种子存在的目的并不是为了让人或动物吃掉,所以种子为了保护自己、繁殖后代,它一定会含有一些毒素或者抗营养因子,抗营养因子简写就是ANF。这些抗营养因子的存在实际上是大豆等植物本身自然进化的结果,为了提高动物的消化率,达到更好的生产性,我们就要想办法把它去除或者钝化掉,热敏型的抗营养因子通过加热就能去除,比如抑制蛋白质消化率的因子:胰蛋白酶抑制因子、糜蛋白酶抑制因子、大豆凝集素。还有一些是不容易通过加热的方式去除的,比如大豆寡糖,还有抗原蛋白也就是我们常说的β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白,还有一种是大家都知道但国内很少谈的植酸,实际上植酸也是一种抗营养因子。除此之外,抗维生素因子和其他抗营养因子可以通过加热法去除。今天和大家着重交流的是图中标红的5个抗营养因子,哈姆雷特关于这5个抗营养因子也做了检测方法和积累的数据库。

  胰蛋白酶抑制因子是我们讲的最多的一个抗营养因子,国际上关于胰蛋白酶抑制因子对幼龄动物、雏鸡、雏牛的报告也很多。它叫胰蛋白酶抑制因子是因为它能够跟胰蛋白酶结合,导致胰蛋白酶失活,这样机体就会代偿,再分泌大量内源性的胰蛋白酶,这实际上也是一种内源蛋白的损失,导致高浓度的必需氨基酸流失,破坏了理想氨基酸的平衡,从而引起我们设计的配方当中氨基酸是平衡的,但因为胰蛋白酶抑制因子的存在实际让氨基酸不平衡了,动物的生产性能也受到抑制。另外胰蛋白酶与胰蛋白酶抑制因子结合,使得蛋白的消化率降低,大量没有消化的蛋白质到了肠道后端会引起致病菌的快速繁殖,比如说常见引起回肠炎的胞内劳森菌、大肠杆菌或梭菌,引起腹泻,最终导致饲料利用率的降低、小猪死亡的增加,影响了生产性能。

  胰蛋白酶抑制因子中我们平时研究较多的是Kunitz型(KTI)和Bowman-Birk型(BBI),这两种抑制因子在大豆当中的含量大概有2%,其中大豆中 KTI含量约为1.4%,是主要的胰蛋白酶抑制因子,BBI含量约为0.6%。下面两图是KTI和BBI的氨基酸一级结构图:KTI由181个氨基酸组成的, BBI由71个氨基酸组成。KTI的活性抑制中心是在第63个氨基酸精氨酸和第64个氨基酸异亮氨酸,但是它本身分子比较大,所以通过加热的方式就能够去除,而且二硫键不多。而BBI的半胱氨酸比较多,有14个半胱氨酸,所以有7个二硫键,其结构是非常稳定的,通过加热是不容易破坏的。另外它的抑制中心也比较多,有两个抑制中心,这两个活性中心都能够抑制胰蛋白酶,而且它是多重抑制,不仅能够抑制胰蛋白酶,也能够抑制糜蛋白酶,所以KTI可能相对容易通过加热去除,但BBI是不容易去除的,对于抗营养因子我们还要检测。

  少量的寡糖可以说是一种益生源,其对肠道的微生态能起到消毒作用,但如果寡糖量很高会引起肠道后端的微生物甚至一些病原微生物的快速繁殖,产生大量的气体,所以当寡糖含量比较高的时候,其被称之为胀气因子,会导致肠道后端的微生物紊乱,进而引起腹泻或者消化吸收障碍,引起动物的生产性能下降。这里讲的寡糖,实际上是在由果糖和葡萄糖组成蔗糖的基础上,通过α-1,6糖苷键连一个半乳糖组成棉子糖,即三糖,如果再连一个半乳糖就是水苏糖,如果再连一个半乳糖就是毛蕊花糖,所以蔗糖、棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖这些我们都称为寡糖。当由α-半乳糖苷键组成的寡糖含量高的时候会有不良影响,所以被称为胀气因子,寡糖的检测方法我们也有。

  主要的两个引起肠道致敏反应、破坏肠绒毛的抗原是:7S组分的β-伴球蛋白和 11S组分的球蛋白。伴球蛋白和球蛋白通过超速离心的方法有一个含量的比值,伴球蛋白大概占整个蛋白的41%,球蛋白占整个蛋白的31%。但如果我们用免疫的方法测定,其含量跟离心的方法是有差别的。因为我们去除大豆抗原的目的是防止小猪产生腹泻,防止小猪对大豆的吸收消化率下降,因此更偏重于用免疫的方法来测定,这也是我们今天要讲的测定方法和测定数据库的一个重点。抗原对幼龄动物的肠道影响,比如说断奶小猪恢复要两天的时间,而这两天时间足以导致腹泻,使得整个生产性能出现下降。

  凝集素的种类也很多,它是一类糖蛋白。凝集素不单单会引起红细胞的凝集,也和抗原一样会引起肠道的致敏反应,从而导致犊牛或者仔猪的腹泻,从而影响生产性能。实验报告是在大鼠上做的:对照组是10%乳蛋白,实验组1是10%大豆乳清,实验组2是外源添加0.75%大豆凝集素,还有一个对照组是2.8%胰蛋白酶抑制因子。从数据上可以看到有凝集素的实验组体增重明显要比对照组降低不少。含有凝集素的日粮,导致肠道过敏反应,进而引起肠道平滑肌增厚增生,导致肠道出现炎症,进而降低肠道对营养物质的吸收,出现动物的生长停滞和腹泻现象。

  植酸是一种含磷有机酸,不仅能抑制磷的吸收,也能够结合其他重要矿物营养元素,如钙、镁、铁和锌等,降低这些矿物元素的利用率。另外它与蛋白质是有关系的,植酸的存在还能降低蛋白质的消化利用率。哈姆雷特在一些产品当中是加了植酸酶来进行酶解,把植酸磷释放出来了,所以哈姆雷特蛋白的有效磷高于普通豆粕和膨化大豆。

  一般我们国内很多人讲到抗营养因子,尤其是抗原蛋白,会用到SDS聚丙烯凝胶电泳图,从下图中,我们通过跟Marker来比,可以明确的看出7S组分的β-伴球蛋白的α亚基、α亚基和β亚基,11S组分的大豆球蛋白的酸性亚基和碱性亚基。我们也跟第三方机构做了很多这样的测定工作,比如说做大豆中不同分子量肽的分布图,我发现做电泳或者做HPLC来做不同分子量肽的分布时,他们是用流动项来提取蛋白的,他们的流动项是20%乙腈+80%水溶液+三氟乙酸,来把其中的蛋白质溶到它的流动项当中。后来我与检测机构沟通,我说你的流动项能不能够把大豆蛋白的所有蛋白都能溶,他说不能。所以当你做这种小肽分布来看你大豆中蛋白变化的时候,你更多的是看一个趋势,而不能够研究蛋白总体的变化情况。但是当蛋白结构如果被降解成7S或11S相对小一点的片段,更多的抗原结构可能被暴露出来,比如说是会引起致敏反应的8到12个氨基酸这样的一个表位抗原的片段反而暴露出来了,结果更容易致敏反应了,所以用试剂盒去测定抗原蛋白就会发现,当蛋白被降解以后,反而抗原性还增加了。所以我们更愿意用免疫的方法来测定这些抗原蛋白的含量,当然为了快速测定一些糖分,我们用薄层色谱(TLC),当然这跟国内的HPLC或者ELISA的方法实际类似。

  饲料厂为了简单快速地测定胰蛋白酶抑制因子,以前都会跟脲酶活性联系起来,通过测定脲酶活性来快速判断胰蛋白酶抑制因子的含量。但是用相同的处理方式,用脲酶和用胰蛋白酶因子的酶化学方法来测定它的含量是有差别的,尽管脲酶活性与胰蛋白酶因子的活性是相关的,可以代表它的高低,但实际上是不准确的。从测定结果的区别而言,用酶化学方法,即分光光度法的测定值远大于脲酶代换法的测定值,而且脲酶代换法是通过PH值的变化来测定的,所以我们认为是不准确的。哈姆雷特丹麦实验室采用AOCS的分光光度计测定方法,即酶化学法,这个方法已经使用二十几年了。2006年的农业农村部的标准方法,除称样量不一样 ,其他的测定过程、比色过程等都一模一样。但是测定更敏感的是用ELISA免疫测定法,国内的研究机构已经开发出了这种方法,而且敏感性也非常好。ELISA免疫测定法没有做成国标,我想它的限制因素是因为它做成单克隆抗体难度要高一些,但是它的敏感性是没问题的,能够检测到ng/ml,是非常低的。这是胰蛋白酶抑制因子的检测方法。

  寡糖的检测,哈姆雷特在国内有合作机构,也有国标检测方法,其通过高效液相色谱(HPLC)来测定。哈姆雷特丹麦实验室要对每一批进来的原料都要快速有效的检测其大豆寡糖的含量,使用方法是TLC,也就是薄层色谱法:在层析纸上用标准品和大豆样品分别点样,展开以后可以看到水苏糖、棉子糖、半乳糖、蔗糖,通过与标准品比较来测出它的含量。其跟HPLC的原理是一样的,但检测更快速,在生产当中帮助哈姆雷特对这批产品进行快速的检测。

  植酸的检测方法,哈姆雷特蛋白公司一直采用的是在德国霍恩海姆大学的测定方法基础上进行改进的方法。国内没有国标,使用的是张丽英老师的资料分析手册上的三氯乙酸提取。两者方法实际上都是用酸将植酸溶解出来,再将溶解出来的植酸通过过量的铁沉淀,通过测定铁或植酸来得到植酸磷的含量,只是方法稍有不同。

  测定大豆凝集素的方法基本上分为凝集反应法和免疫测定法。哈姆雷特蛋白公司使用TNO的双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定样品中凝集素的含量。方法与国内检测方法基本一致。哈姆雷特蛋白在欧洲实验室检测β-伴球蛋白、大豆球蛋白和凝集素都是用TNO的双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA):将做成多克隆抗体固定到酶标板的微孔当中,当你把待测样品或标准抗原加入到微孔板以后,两者会发生抗原-抗体结合反应。一段时间以后,部分抗原就会跟固定相上的抗体结合,而没有特异结合的抗体就被洗掉了,然后再加有酶标记的“二抗”,最终就形成了抗体-抗原-抗体的复合物。双抗体夹心ELSA方法的要求较高,首先要做多克隆抗体,抗原要有多个结合位点与抗体结合才能够出现双抗夹心,然后再用酶做比色即常规的ELSA方法来检测出含量,其颜色的变化即吸光度的变化是跟结合上的抗原数量成正比的,直接就可以计算出要检测的大豆抗原、β伴球蛋白或凝集素的含量。TNO方法的量程是非常广的,这也是我们这么多年一直应用这个方法来检测不同酶解大豆或者不同加工方法的大豆蛋白中的不同抗原和凝集素的原因。

  2021年下半年因疫情以及2022年因俄乌战争的原因,国外实验室不能接受国内送检的粉末状样品,所以我们选择了国内的检测盒。国内的试剂盒使用的间接抑制法来做的。是将抗原固定,然后加入待测物品的抗原和特异的抗体,两种抗原产生竞争性的反应。如果待测样品中的抗原含量越高,就跟特定的抗体结合率高,特定抗体与被固定在酶标板的抗原结合率就低。当抗体结合上以后,再用酶标的二抗去跟抗体结合,然后通过吸光度的变化来测定。如果被检测标准品中的抗原越高,抗体跟固定相上的抗原结合就越少,所以吸光度跟检测的抗原是成反比的,但这个反比不是直线型的反比,而是指数级的反比,所以这个方法的优点是灵敏度很高,但是敏感范围比较窄。当抑制率在IC50(半抑制浓度)是最敏感的,能够正好抑制抗原抗体结合,所以在IC50上下有一个敏感范围,但是量程敏感范围比较短,所以在用试剂盒测定普通豆粕、大豆浓缩蛋白、哈姆雷特蛋白或者国内其他深加工大豆蛋白产品时候,其抗原量的差别特别大,可能落在了试剂盒的检测范围之外,就要用提取方法或者其他方法来做一些调整才能达到准确的检测。

  哈姆雷特丹麦实验室在全球已检测约2000个样品,客户送样大豆蛋白样品近1500个,截至目前全球开展R&D试验共计404个。哈姆雷特内部品控ANF是原料批批检测,成品是每周检测,不同的指标有不同的检测方法,所以积累了大量数据库,这些数据非常有意义,所以我做了汇总,通过本次机会介绍给大家。从生大豆到深加工大豆(分离大豆蛋白、大豆浓缩蛋白等),蛋白质随着加工的深入,其纯度越来越高。我们通过测蛋白、灰分、纤维、碳水和脂肪等含量,发现生大豆或全脂大豆中的脂肪比较高,随着加工的深入,蛋白越来越高,脂肪越来越少。我们现在还在研发碳水化合物、纤维这一部分,从6月开始欧盟就会对高剂量的氧化锌全面禁止使用,很多人在肠道健康方面研究了纤维素是否能够起到代替氧化锌或者防治腹泻的作用。当然我们也有相关报告,虽然这是营养指标不是抗营养因子,但我们也做了一些纤维上的研究。

  哈姆雷特做的1500个客户样品,我进行了分类:大豆浓缩蛋白类200个,去皮豆粕120个,发酵豆粕在前几年我加入哈姆雷特时只有几十个,现在全球我们检测的有150个,最近亚洲国家的中国、日本、韩国送检的比较多,所以在我们丹麦数据库中积累了很多发酵豆粕的样本数据。大家如果感兴趣,可以在未来与大家进行分享。以胰蛋白酶抑制因子为例,全脂大豆或者生大豆中的胰蛋白酶抑制因子的变异值是非常大的,去皮豆粕就相对比较小,发酵豆粕的变异值很大,哈姆雷特蛋白HP300中的胰蛋白酶抑制因子量非常稳定。当然关于寡糖、凝集素、植酸磷我们也有相关报告,这里不一一展开了。

  大豆蛋白中ANF含量特点分析,SBM豆粕类:各类抗营养因子均高;SPC大豆浓缩蛋白类:寡糖去除的比较干净,抗原蛋白却决于加工工艺;FSBM发酵豆粕类:变异最大,一般寡糖可以除去很干净,但大部分其他ANF是不合格的;FFS全脂大豆类:各类抗营养因子均高;EFFS全脂膨化大豆类:膨化FFS的TIA低一些,其他仍然较高;ESBM普通酶解豆粕:质量千差万别,大部分ANF含量均高;组合类:非大豆蛋白类ANF较低,如果含有豆类蛋白则一般抗原蛋白较高。以上是全球的特点,再来看中国:从2017年我们在中国有销售团队以来,截止到目前一共送样226个,都是客户送给我们的,我们送到丹麦实验室去做抗营养因子的检测。2022年因国内疫情原因,送样品出国是封锁的,所以无法送到丹麦实验室。2021年下半年和2022年,我们通过国内一些第三方检测机构进行不同抗营养因子的检测。我们每年也做研发,也有一些样品的检测,将其归为以下几类:

  全脂膨化大豆中ANF总结:全脂膨化大豆的胰蛋白酶抑制因子TIA平均值为30.26mg/g蛋白质。最高值为95.00mg/g,最低值为7.5mg/g。数据的变异值范围很大;β-伴大豆球蛋白平均值为39872.64ppm。最高值为300000ppm,最低值为431ppm。数据的变异值范围很大;水苏糖含量平均值为4.16%。最高值为6%,最低值为3%;棉籽糖含量平均值为0.70%。最高值为0.9%,最低值为0.4%;全脂膨化大豆由于膨化工艺处理,去除了少部分热敏性的抗营养因子ANF,例如胰蛋白酶抑制因子,但TIA的含量仍然很高,平均值高达30.26mg/g。膨化大豆加工对热不敏感的β-伴大豆球蛋白含量影响不大,平均含量在39872ppm,而且抗原蛋白的变异值范围也很大。大豆的膨化处理对寡糖无效,因此水苏糖含量很高。

  发酵豆粕中ANF总结:发酵豆粕的粗蛋白平均值为50.46%.最高值为53.98%,最低值为44.60%;发酵豆粕的胰蛋白酶抑制因子TIA平均值为4.55mg/g蛋白质。最高值为29.50mg/g,最低值为0.90mg/g。数据的变异值范围很大;β-伴大豆球蛋白平均值为26032.87ppm。最高值为127836ppm,最低值为13ppm。变异较大;水苏糖含量平均值为2.33%。最高值为4.3%,最低值为0.25%;棉籽糖含量平均值为0.71%。最高值为1.90%,最低值为0.10%;发酵豆粕的ANF结果取决于发酵过程及后续烘干工艺的控制,工艺本身的复杂性导致ANF处理结果变异值非常大。因此有少部分ANF合格的产品,例如样品第21号,但整体看质量参差不齐,胰蛋白酶抑制因子TIA、抗原蛋白β-伴大豆球蛋白和寡糖含量的变异值范围很大。

  低蛋白豆粕中ANF总结:胰蛋白酶抑制因子TIA的平均值为9.5mg/g蛋白质。最高值为14.1mg/g,最低值为5.9mg/g;β-伴大豆球蛋白平均值为:44207ppm,最高值为86835ppm,最低值17039ppm;豆粕生产一般是包括化学浸提和烘干加热两种工艺,没有对ANF做专门处理,因此ANF含量很高,且变异值范围很大。

  高温挤压或膨化豆粕中ANF总结:膨化豆粕的TIA平均值为3.59mg/g。最高值为5.1mg/g,最低值为2.2mg/g;β-伴大豆球蛋白平均值为35342ppm。最高值为130000ppm,最低值为8348ppm。数据的变异值范围很大;水苏糖含量平均值为3.57%。最高值为4%,最低值为3%;膨化豆粕在生产工艺上因为多了一道膨化处理,而去除了热敏性ANF,因此TIA含量比豆粕大为降低,但膨化豆粕中对热不敏感的β-伴大豆球蛋白含量仍然很高,变异值范围也很大,同时膨化处理无法去除寡糖,因此水苏糖、棉籽糖和蔗糖的含量也很高。

  HP300中ANF总结:HP300的酶解工艺和烘干工艺可以有效去除胰蛋白酶抑制因子,HP300中的 TIA平均值为2.60mg/g蛋白质。最高值为3.00mg/g,最低值为2.20mg/g。数据稳定,变异值范围很小;β-伴大豆球蛋白平均值为1.38ppm。最高值为2.0ppm,最低值为0.5ppm;水苏糖含量平均值为0.53%。最高值为0.9%,最低值为0.3%;棉籽糖含量平均值为0.17%。最高值为0.25%,最低值为0.01%;

  4个HP300样品有的是客户送盲样的检测结果,测定之前哈姆雷特蛋白并不知道哪一个样品是HP300;HP300的工艺对抗营养因子的处理较为干净,因此抗胰蛋白酶抑制因子含量很低平均在2.6mg/g蛋白;β-伴大豆球蛋白含量更为稳定在2ppm以下。水苏糖、棉籽糖和蔗糖的寡糖总量控制在1.0%以下。

  基于以上数据库和实际生产中的饲养实验、养殖实验,我们提供给饲料厂配方师或养殖场技术人员一个建议阈值。欧洲在2000年到2005年在饲料中通过不同的加工方式去除胰蛋白酶因子,并通过实验设计计算出胰蛋白酶因子的日摄入量,分别得到日摄入量1g、2g到5.5g对应的生产性能。实验用的是10公斤的小猪,处于快速生长期,所以不同实验组日增重差异明显:胰蛋白酶抑制因子摄入量小于1g时,日增重就能达到600g。胰蛋白酶抑制因子摄入量越高,小肠绒毛被破坏的越严重,料肉比不合适,增重下降。根据以上实验原文数据进行计算后得出:胰蛋白酶抑制因子在教槽料阶段,我们建议在饲料中的上限值是0.3mg/g,在保育前期饲料中的上限值是0.7mg/g。同理,从张立英老师发表的一篇文章中的结果可以看出:无水苏糖组即不含大豆蛋白组的生产性能是最好的,其日增重和腹泻都是最低的。含有大豆和含有1%水苏糖组类似。可以得出的结论:对于小猪日粮的水苏糖含量至少低于0.8%,寡糖含量不高于1%才行。抗原蛋白很少有人专门去做不同PPM对生产性能的影响,但是有做对肠道绒毛结构的影响。在德国宾根科技大学杜塞尔教授的一个论文中:使用普通豆粕在含有较高抗原的情况下,其对肠粘膜绒毛损害很厉害,出现黏膜细胞脱落,而低抗原的HP300肠绒毛是非常完整的,证明大豆抗原实际上对生产是有影响的。

  在17日龄的肉鸡罗斯308日粮当中加入不同剂量的胰蛋白酶抑制因子,研究其对生产性能的影响。发现胰蛋白酶抑制因子含量增高,日增重就降低,并且这种影响可以一直检测到38日龄。我们把对17日龄肉鸡生长性能的影响结果做成拟合曲线,得到拟合方程。该实验为2020年测定,通过查询罗斯308肉鸡生产性能手册(2019年),得到17日龄的标准体重应该为701g,代入拟合方程得到x=1.43mg/g,也就是说达到征程生产性能的日粮胰蛋白酶抑制因子含量值应该小于1.43mg/g。通过外源添加提纯寡糖来看剂量对生产性能影响:0寡糖时日增重不高,随寡糖含量增加而日增重增加。通过日增重数据制图:日粮中寡糖含量0-1%时,日增重随剂量增加而生产性能提高,因为少量寡糖有益生元的作用。但是剂量超过1%时,生产性能不再变化。从FCR饲料转化率来看,肉雏鸡日粮中0.9-1.8%范围内的寡糖肉鸡获得了最佳的饲料转化效率料肉比,结合日增重指标制作拟合曲线,我们计算的肉鸡开口料最佳寡糖剂量为1.25%

  关于犊牛我们没有专门做实验,很多研究都表明如果大豆抗原含量比较高,犊牛肠道绒毛会受到破坏,如果不含抗原,肠绒毛就比较好,这与单胃动物是一样的。查询到一个中国农科院的博士论文实验是在代乳粉当中添加大豆粉、全脂大豆粉和膨化大豆粉,可以看到随着不同抗原量的增加,肠道内胰蛋白酶活性比不添加代乳粉的对照组明显降低,尤其是生大豆粉中的胰蛋白酶和糜蛋白酶活性要比对照组远远降低。

  综上所述,幼龄动物无论是犊牛、肉鸡、断奶仔猪都对大豆抗原营养因子有类似反应。我们通过总结得到不同幼龄动物抗营养因子的适宜含量推荐表,希望能给到饲料厂配方师在做幼龄动物配方时有一个参考标准:

  最后希望疫情能早点过去,更多的样品能被送到哈姆雷特丹麦实验室进行检测,当然我们也会加快在中国寻找第三方一起开发更好的检测方法。今天的分享就到这里,谢谢大家!

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